Совместное применение SSR- и ISSR-маркеров для изучения генетического разнообразия сельскохозяйственных культур

УДК 633.521:631.527

Совместное применение SSR- и ISSR-маркеров для изучения генетического разнообразия сельскохозяйственных культур

Базанов Т. А., кандидат химических наук

Ущаповский И. В., кандидат биологических наук

Логинова Н. Н.

Смирнова Е. В.

Михайлова П. Д.

ФГБНУ «Федеральный научный центр лубяных культур»

170041, Россия, г. Тверь, Комсомольский пр-т, д. 17/56

E-mail: t.bazanov@fnclk.ru

Применение различных ДНК-маркеров давно зарекомендовало себя как востребованный метод исследования биологических объектов. При этом совместное использование маркерных систем разного типа показывает более высокую эффективность. Целью работы стало совместное изучение полиморфизма различных сельскохозяйственных культур с использованием маркеров Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) и Simple Sequence Repeat (SSR). Работа выполнена в ФГБНУ «ФНЦ ЛК» (г. Тверь). Объектами данного исследования стали 18 современных сортов рыжика посевного и 10 сортов конопли посевной, включённых в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации. Рыжик посевной (Camelina sativa L.) — масличная культура, характеризующаяся высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот в масле семян. Конопля посевная (Cannabis sativa L. subsp. sativa) — техническая культура комплексного применения, традиционно используемая для получения волокна и масла. Обе культуры являются перспективными и могут служить в качестве модельных объектов. Генетический анализ проводился методом ПЦР с использованием специально подобранных наборов SSR- и ISSR-маркеров отечественной и зарубежной разработки. Генетические маркеры позволили выявить в исследуемых сортах рыжика и конопли большое количество разнообразных аллелей, построить карты филогенетических отношений исследованных культур. Совместное использование SSR- и ISSR-маркеров позволило расширить знания о уровне полиморфизма исследованных сортов, разделить и идентифицировать близкородственные сорта, дифференцировать озимые и яровые генотипы, выявить уровень генетической близости сортов в зависимости от их происхождения. Дендрограммы филогенетических отношений позволили показать отличия в данных, получаемых при применении различных маркерных систем, и сделать вывод о полезности их совместного использования при исследовании генетического разнообразия сельскохозяйственных культур.

Ключевые слова: SSR-, ISSR-, ДНК-маркер, рыжик посевной, конопля посевная, генетическое разнообразие.

Генетическое разнообразие сельскохозяйственных культур позволяет создавать сорта и гибриды, сочетающие наиболее востребованные характеристики. Генетический полиморфизм является основой естественного и искусственного отбора (Алтухов, 2003), поэтому в последние десятилетия в мире всё большее внимание уделяется изучению и сохранению генетического разнообразия.

Получение информации о генетической структуре сельскохозяйственных культур связано с использованием ДНК-маркеров, позволяющих анализировать любые ткани и органы независимо от стадии развития организма (Сулимова, 2004). Существует большое количество молекулярных маркеров и методов их детекции. Все они обладают определёнными достоинствами и недостатками. Считается, что наиболее информативные молекулярные маркеры для селекции должны обладать следующими свойствами: высокой степенью полиморфности, надёжностью и воспроизводимостью, а также должны быть относительно равномерно распределены по геному и легко анализируемы (Конарев, 2006; Agarwal, 2008).

Одним из хорошо известных и простых методов генетического анализа растений в популяционной генетике, молекулярной таксономии, картировании геномов, а также способом выявления соматических мутаций является микросателлитное праймирование (Бобошина, Боронникова, 2012). В основе метода ISSR-анализа лежит анализ амплифицированных полиморфных участков ДНК между микросателлитными повторами. Такие праймеры позволяют амплифицировать уникальные последовательности ДНК, которые могут быть проанализированы при помощи агарозного гель-электрофореза. Довольно часто в ходе исследований выясняется, что некоторые ISSR-праймеры больше подходят для генетического анализа популяций, тогда как другие могут быть полезны для изучения межвидовых взаимосвязей (Костюкова, Заякин, 2013).

Микросателлиты (SSR) представляют собой тандемные повторы, включающие обычно от двух до четырёх нуклеотидов. Микросателлиты обнаружены во всех эукариотических и прокариотических геномах (Li, Korol, 2004). Праймерами выступают последовательности, фланкирующие микросателлиты, они могут быть уникальными. В результате обычно идентифицируют один мультиаллельный локус. Аллели, сильно отличные по длине, могут быть разделены в агарозном геле, но обычно для анализа результатов SSR-PCR используют секвенирующие гели, на которых можно увидеть различия в один нуклеотид. Таким образом, можно детектировать каждый аллель.

Совместное изучение различных ДНК-маркеров расширяет возможности генетических исследований для широкого круга сельскохозяйственных культур, в том числе перспективных (рыжика и конопли), селекция которых ведётся в ФГБНУ «ФНЦ ЛК».

Рыжик посевной (Camelina sativa L. Crantz) характеризуется значительной стабильностью при высоких температурах и дефиците влаги, а также устойчивостью к болезням и вредителям. В последние годы в России наметилась тенденция к возрождению этой давно известной культуры (Прахова, 2022). Рыжик является интересным модельным видом, особенно для тестирования потенциальных генетических применений, основанных на исследованиях с использованием ДНК-маркеров.

Конопля посевная (Cannabis sativa L. subsp. sativa) — древнейшая техническая культура комплексного использования, традиционно применялась для получения волокна и масла. Результаты работы селекционеров ФГБНУ «ФНЦ ЛК» позволили получить высокопродуктивные сорта конопли, включённые в список Госсорткомиссии (Серков, Бакулова, 2019). Сложности селекционной работы с коноплёй связаны с её биологическими особенностями: двудомностью, внутрисортовой гетерозиготностью, высокой степенью изменчивости в зависимости от условий окружающей среды (Onofri, Mandolino, 2017).

Использование молекулярных маркеров для исследования геномов современных сортов сельскохозяйственных культур позволяет оценить и сопоставить уровни их генетического разнообразия, выделить ценные для селекции генотипы или подобрать оптимальные пары для последующей гибридизации. Целью работы стало комплексное изучение полиморфизма ряда современных российских сортов рыжика посевного и конопли посевной с использованием ДНК-маркеров различного типа.

Методика исследований. Восемнадцать сортов рыжика посевного различного географического происхождения (табл. 1) и 10 сортов конопли посевной (табл. 2) были использованы в качестве объектов исследований. Все сорта включены в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Российской Федерации.

1. Исследованные сорта рыжика посевного

2. Исследованные сорта конопли посевной

Для проведения SSR-анализа рыжика посевного использовался набор из восьми пар праймеров (Базанов, Ущаповский, 2021), для SSR-анализа конопли посевной был применён набор из 10 пар праймеров (Базанов, Ущаповский, 2020). Все прямые SSR-праймеры были мечены флюоресцентными красителями. Для ISSR-маркирования двух культур был применён один набор из 20 ISSR-праймеров (табл. 3), показавших хорошие результаты в работах (Kojoma, Iida, 2002; Zhang, Chang, 2014). Все использованные в работе праймеры были синтезированы компанией «СИНТОЛ» (Россия). ДНК выделяли с помощью СТАВ-метода. Реакционная смесь ПЦР объёмом 25 мкл содержала: 20 нг исследуемой ДНК, необходимое количество праймеров (оптимальные количества определялись экспериментально), 200 мкМ dNTP, 2,5 мкМ MgCl₂ и 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР осуществляли на амплификаторе Т100 MyCycler™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) при условиях: начальная денатурация 5 мин при 94°С; далее следовали 35 циклов: денатурация 30 с при 94°С, отжиг в течение 30 с (температуру подбирали в зависимости от праймеров), элонгация 30 с при 72°С; терминальная элонгация 30 мин при 72°С. ПЦР-продукты в SSR-анализе были детектированы методом фрагментного анализа на генетическом анализаторе «НАНОФОР 05» (СИНТОЛ, Россия) с использованием маркера молекулярного веса СД-450 (СИНТОЛ, Россия). Продукты амплификации в ISSR-анализе разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле в 1×ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR (Bio-Rad, США). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp + 1,5 + 3 Кb DNA Ladder). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, США). Для компьютерной обработки полученные результаты были представлены в виде матрицы бинарных данных. Для построения дендрограммы генетического подобия методом neighbor joining method (Nei, 1973) использовали программное обеспечение DARwin v. 6 (DARwin software).

3. Нуклеотидные последовательности использованных ISSR-маркеров

Результаты исследований. Сопоставление данных, полученных с использованием различных типов молекулярных маркеров (ISSR- и SSR-) на двух культурах (рыжике и конопле), позволило не только подтвердить наличие высокой степени полиморфизма у изученных сортов, но и выявить особенности, которые не проявлялись при анализе с помощью только одного метода.

В ходе SSR-анализа 18 сортов рыжика посевного было определено 40 аллелей размером от 119 до 323 пар нуклеотидов, и среднее число аллелей на локус составило пять. Более полные статистические данные SSR-маркирования и генетические паспорта исследованных образцов рыжика представлены в работе авторов (Базанов, Ущаповский, 2021). Данные ISSR-анализа рыжика посевного выявили 52 аллели размером от 130 до 1550 п.н., 38 из которых отличаются высоким уровнем полиморфизма.

При сопоставлении данных, полученных различными методами, уровень полиморфизма был стабильно высоким: 77% — для SSR- и 73,8% — для ISSR-анализа. Сопоставление дендрограмм генетического подобия по данным SSR- и ISSR-анализа также выявили ряд подобий и отличий (рис. 1, 2).

По результатам рассмотрения дендрограммы SSR-анализа изученные сорта рыжика посевного прежде всего разделились на два кластера, объединивших сорта яровой (1а) и озимой (1b) форм. Внутри каждого из двух кластеров отмечаются группы, различающиеся по оригинатору. В кластере 1а такими сортами являются Велес и Юбиляр пензенской селекции, старые сибирские сорта Ужурский, Чулымский и новый Омич. Расположение испанского сорта Вилла указывает на наличие родственных связей с сибирскими сортами. Несмотря на высокий уровень полиморфизма линейки SSR-маркеров, яровые сорта Кристалл и Исилькулец (оригинатор ВНИИМК) не удалось разделить, хотя они различны по времени создания и месту непосредственной селекции. Вероятно, в данном случае для их дифференциации могут потребоваться дополнительные SSR-маркеры. Среди озимых сортов (кластер 1b) хорошо группируются сорта саратовской (Передовик и Адамас) и пензенской (Козырь, Пензяк, Барон) селекции. Сорт Адонис связан с пензенскими сортами по причине присутствия сорта Козырь в его родословной. Старый сорт ВНИИМК-520 занимает в дендрограмме обособленное положение.

Рис. 1. Дендрограмма генетического подобия сортов рыжика посевного по данным SSR-анализа

Дендрограмма генетического подобия по данным ISSR-анализа рыжика даёт нам дополнительные данные о генетическом разнообразии культуры. Анализ разделил сорта рыжика на два больших кластера, предполагающих распределение на географические группы: среднерусского (2а) и сибирского (2b) типа. Обособленность сорта Адонис определяется близким родством к сортам рыжика украинской селекции.

Рис. 2. Дендрограмма генетического подобия сортов рыжика посевного по данным ISSR-анализа

ISSR-анализ выявил более сильное разделение сортов по оригинаторам, чем при SSR-анализе. Это отмечается при рассмотрении группировки всех пензенских сортов (Барон, Велес, Козырь, Пензяк, Юбиляр), сортов саратовской селекции (Дебют, Передовик, Адамас), сортов селекции омского филиала ВНИИМК (Кристалл, Исилькулец, Омич, Карат) и сортов новосибирского происхождения (Чулымский, Ужурский). ISSR-анализ позволил также дифференцировать сорта Кристалл и Исилькулец друг от друга. Сорт Вилла в обоих случаях группируется с сибирскими сортами, а сорта Дебют и Екатерининский, принадлежащие разным оригинаторам, группируются вместе, что свидетельствует о наличии общности в родословных.

В результате проведённых работ на 10 сортах конопли посевной были получены данные по полиморфизму изученных сортов. SSR-анализ определил 70 аллелей размером от 68 до 323 п.н. и среднее число аллелей на локус (7). Более полные статистические данные SSR-маркирования и генетические паспорта исследованных образцов конопли представлены в работе авторов (Базанов, Ущаповский, 2020). Данные ISSR-анализа конопли посевной выявили 99 аллелей размером от 440 до 1500 п.н., 87 из которых оказались полиморфны. Сопоставление результатов использования двух типов маркеров выявило высокий уровень полиморфизма: 72% — для SSR- и 83,2% — для ISSR-маркеров.

Сопоставление дендрограмм генетического подобия по данным SSR- и ISSR-анализа выявляют схожесть и незначительные отличия при кластеризации (рис. 3, 4).

Рассмотрение дендрограммы генетического подобия по данным SSR-анализа позволяет судить о характерной кластеризации исследованных сортов. Образцы распределились по двум группам, соответствующим оригинаторам: в кластер 2а (Вера, Надежда, Сурская, Милена) вошли сорта, созданные ФНЦ ЛК совместно с компанией «Коноплекс», в кластер 2b (Марго, Гентус, Ингреда, Димра, Юлиана) — сорта, основным разработчиком которых выступал ФАНЦ Северо-Востока им. Рудницкого. Сорт Диана занимает промежуточное положение между кластерами, поскольку создавался при непосредственном участии этих двух селекционных центров.

Рис. 3. Дендрограмма генетического подобия сортов конопли посевной по данным SSR-анализа

Дендрограмма на основе ISSR-анализа выявляет три базовых группы, обозначенные на рис. 4 как 4a, 4b и 4c. Это указывает на дополнительную информацию о генетическом разнообразии изученных сортов. Группа 4a содержит три сорта селекции ФНЦ ЛК (Надежда, Вера, Сурская). Это зеленостебельные среднеспелые сорта, полученные скрещиванием южного сорта конопли ЮСО-31 в различных комбинациях. Сорта Надежда и Вера, полученные путём простых скрещиваний, проявляют себя близкородственной группой, а сорт Сурская, выведенный из сложной комбинации, отличается от них.

Рис. 4. Дендрограмма генетического подобия сортов конопли посевной по данным ISSR-анализа

Группа 4b вобрала в себя четыре сорта (Юлиана, Ингреда, Гентус, Диана) по признаку оригинатора — ФАНЦ Северо-Востока им. Рудницкого. Сорт Диана, в SSR-анализе демонстрировавший обособленность, здесь оказался ближе к одному селекционному центру.

Группа 4c объединяет жёлтостебельные раннеспелые сорта среднерусской конопли (Димра, Марго, Милена). Оригинатор сортов Димра и Марго — ФАНЦ Северо-Востока им. Рудницкого. При создании сорта Милена в родословной использовались чувашские линии, что объясняет кластеризацию с сортами кировской селекции.

Заключение. Совместное использование современных молекулярных маркеров различного типа позволяет существенно расширить понимание генетического разнообразия сельскохозяйственных культур. Сорта, созданные географически отдалёнными селекционными центрами, могут иметь родственные связи различного характера, не определяемые по оригинатору. Комплексное использование SSR- и ISSR-маркеров и сопоставление данных по конопле и рыжику позволило повысить информативность данных о генетическом полиморфизме проанализированных сортов, выявить уровень их генетической близости в зависимости от происхождения, разделить близкие сорта, маркерно дифференцировать озимые и яровые формы рыжика, то есть определить признаки, не проявившиеся при анализе только одним методом.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках темы FGSS–2019–0023 Государственного задания ФГБНУ «ФНЦ ЛК».

Литература

1. Алтухов Ю. Г. Генетические процессы в популяциях / Ю. Г. Алтухов. — Москва: Академкнига, 2003. — 432 с.
2. Анализ индивидуальной изменчивости сортообразцов конопли посевной (Cannabis sativa L.) с использованием SSR- и SCAR-маркеров / Т. А. Базанов, И. В. Ущаповский, Н. Н. Логинова, Е. В. Смирнова, П. Д. Михайлова // Аграрная наука. — 2020. — № 10. — С.68–72.
3. Оценка генетического разнообразия сортов рыжика посевного (Camelina sativa L.) с использованием SSR-маркеров / Т. А. Базанов, И. В. Ущаповский, Н. Н. Логинова, Е. В. Смирнова, П. Д. Михайлова // Аграрная наука. — 2021. — № 9. — С.108–112.
4. Бобошина И. В. Изучение генетического полиморфизма некоторых сортов Triticum aestivum L. с использованием ISSR-маркеров / И. В. Бобошина, С. В. Боронникова // Аграрный вестник Урала. — 2012. — № 5. — С.19–20.
5. Конарев А. В. Использование молекулярных маркеров в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / А. В. Конарев // Аграрная Россия. — 2006. — № 6 — С.4–22.
6. Костюкова E. E. Молекулярно-генетический анализ редких видов орхидных Брянской области / Е. Е. Костюкова, В. В. Заякин, И. Я. Нам // Бюллетень Брянского отделения РБО. — 2013. — № 1. — С.51–55.
7. Прахова Т. Я. Анализ и оценка исходного материала для селекции рыжика озимого в условиях лесостепи среднего Поволжья / Т. Я. Прахова // Международный сельскохозяйственный журнал. — 2022. — № 1 (385). — С.75–78.
8. Новые направления селекции и совершенствование технологии семеноводства конопли посевной: монография / В. А. Серков, И. В. Бакулова, И. И. Плужникова, Н. В. Криушин. — Пенза: Пензенский государственный аграрный университет, 2019. — С.155.
9. Сулимова Г. Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г. Е. Сулимова // Успехи современной биологии. — 2004. — Т. 124. — № 3. — С.260–271.
10. Agarwal M. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences / M. Agarwal, N. Shrivastava, H. Padh // Plant cell reports. — 2008. — Vol. 27. — No. 4. — P.617–631.
11. DNA fingerprinting of Cannabis sativa using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification / M. Kojoma, O. Iida, Y. Makino, S. Sekita, M. Satake // Planta Medica. — 2002. — Vol. 68. — No. 01. — P.60–63.
12. Microsatellites within genes: structure, function and evolution / Y. C. Li, A. B. Korol, T. Fahima, E. Nevo // Molecular biology and evolution. — 2004. — Vol. 21. — No. 6. — P.991–1007.
13. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei // Proceeding of the National Academy of Sciences. — 1973. — Vol. 70. — No. 12. — P.3321–3323.
14. Onofri C. Genomics and Molecular Markers in Cannabis sativa L. / C. Onofri, G. Mandolino // Cannabis sativa L. Botany and Biotechnology. — Springer, Cham, 2017. — P.319–342.
15. Analysis of the genetic diversity of Chinese native Cannabis sativa cultivars by using ISSR and chromosome markers / L. G. Zhang, Y. Chang, X. F. Zhang, F. Z. Guan, H. M. Yuan, Y. Yu, L. J. Zhao // Genetic and Molecular Research. — 2014. — Vol. 13. — No. 4. — P.490–500.

Combination of SSR- with ISSR-markers to test crop genetic diversity

Bazanov T. A., PhD Chem. Sc.

Ushchapovskiy I. V., PhD Biol. Sc.

Loginova N. N.

Smirnova E. V.

Mikhaylova P. D.

Federal Research Center of Fibre Crops

170041, Russia, Tver, Komsomolskiy prospect, 17/56

E-mail: t.bazanov@fnclk.ru

Use of DNA markers is a common method for studying biological objects. Combination of different markers showed higher effectiveness. The aim was to detect DNA polymorphism of various crops via Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) and Simple Sequence Repeat (SSR) techniques. This experiment was conducted at the Federal Research Center of Fibre Crops (Tver) on 18 varieties of Camelina sativa and 10 varieties of Cannabis sativa enlisted in the State Register of Breeding Achievements Authorized for Use for Production Purposes in the Russian Federation. Camelina sativa L. — an oil crop with a high content of unsaturated fatty acids in seed oil. Cannabis sativa L. subsp. sativa — an industrial crop used conventionally for fiber and oil production. Both plants are promising crops and convenient model objects. Genetic analysis based on PCR used a set of domestic and foreign SSR- and ISSR-markers. Genetic markers identified a large number of various alleles in Camelina sativa and Cannabis sativa and enabled the construction of phylogenetic trees for the crops under investigation. Combination of SSR- with ISSR-markers resulted in more effective polymorphism detection, differentiation and identifiсation of closely related varieties, distinction of winter genotypes from the spring ones as well as identification of the level of genetic similarity depending on a variety origin. Phylogenetic analyses showed the impact of different markers on the data obtained and the advantages of marker combination when studying the genetic diversity of crops.

Keywords: SSR-, ISSR-, DNA-marker, Camelina sativa, Cannabis sativa, genetic diversity.

References

1. Altukhov Yu. G. Geneticheskie protsessy v populyatsiyakh / Yu. G. Altukhov. — Moscow: Akademkniga, 2003. — 432 p.
2. Analiz individualnoy izmenchivosti sortoobraztsov konopli posevnoy (Cannabis sativa L.) s ispolzovaniem SSR- i SCAR-markerov / T. A. Bazanov, I. V. Ushchapovskiy, N. N. Loginova, E. V. Smirnova, P. D. Mikhaylova // Agrarnaya nauka. — 2020. — No. 10. — P.68–72.
3. Otsenka geneticheskogo raznoobraziya sortov ryzhika posevnogo (Camelina sativa L.) s ispolzovaniem SSR-markerov / T. A. Bazanov, I. V. Ushchapovskiy, N. N. Loginova, E. V. Smirnova, P. D. Mikhaylova // Agrarnaya nauka. — 2021. — No. 9. — P.108–112.
4. Boboshina I. V. Izuchenie geneticheskogo polimorfizma nekotorykh sortov Triticum aestivum L. s ispolzovaniem ISSR-markerov / I. V. Boboshina, S. V. Boronnikova // Agrarnyy vestnik Urala. — 2012. — No. 5. — P.19–20.
5. Konarev A. V. Ispolzovanie molekulyarnykh markerov v reshenii problem geneticheskikh resursov rasteniy i selektsii / A. V. Konarev // Agrarnaya Rossiya. — 2006. — No. 6 — P.4–22.
6. Kostyukova E. E. Molekulyarno-geneticheskiy analiz redkikh vidov orkhidnykh Bryanskoy oblasti / E. E. Kostyukova, V. V. Zayakin, I. Ya. Nam // Byulleten Bryanskogo otdeleniya RBO. — 2013. — No. 1. — P.51–55.
7. Prakhova T. Ya. Analiz i otsenka iskhodnogo materiala dlya selektsii ryzhika ozimogo v usloviyakh lesostepi srednego Povolzhya / T. Ya. Prakhova // Mezhdunarodnyy selskokhozyaystvennyy zhurnal. — 2022. — No. 1 (385). — P.75–78.
8. Novye napravleniya selektsii i sovershenstvovanie tekhnologii semenovodstva konopli posevnoy: monografiya / V. A. Serkov, I. V. Bakulova, I. I. Pluzhnikova, N. V. Kriushin. — Penza: Penzenskiy gosudarstvennyy agrarnyy universitet, 2019. — P.155.
9. Sulimova G. E. DNK-markery v geneticheskikh issledovaniyakh: tipy markerov, ikh svoystva i oblasti primeneniya / G. E. Sulimova // Uspekhi sovremennoy biologii. — 2004. — Vol. 124. — No. 3. — P.260–271.
10. Agarwal M. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences / M. Agarwal, N. Shrivastava, H. Padh // Plant cell reports. — 2008. — Vol. 27. — No. 4. — P.617–631.
11. DNA fingerprinting of Cannabis sativa using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification / M. Kojoma, O. Iida, Y. Makino, S. Sekita, M. Satake // Planta Medica. — 2002. — Vol. 68. — No. 01. — P.60–63.
12. Microsatellites within genes: structure, function and evolution / Y. C. Li, A. B. Korol, T. Fahima, E. Nevo // Molecular biology and evolution. — 2004. — Vol. 21. — No. 6. — P.991–1007.
13. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei // Proceeding of the National Academy of Sciences. — 1973. — Vol. 70. — No. 12. — P.3321–3323.
14. Onofri C. Genomics and Molecular Markers in Cannabis sativa L. / C. Onofri, G. Mandolino // Cannabis sativa L. Botany and Biotechnology. — Springer, Cham, 2017. — P.319–342.
15. Analysis of the genetic diversity of Chinese native Cannabis sativa cultivars by using ISSR and chromosome markers / L. G. Zhang, Y. Chang, X. F. Zhang, F. Z. Guan, H. M. Yuan, Y. Yu, L. J. Zhao // Genetic and Molecular Research. — 2014. — Vol. 13. — No. 4. — P.490–500.