Методы биотехнологии для создания кислотоустойчивых образцов клевера лугового с повышенной семенной продуктивностью

УДК 633.321:631.524.85

Методы биотехнологии для создания кислотоустойчивых образцов клевера лугового с повышенной семенной продуктивностью

Солодкая Л. А., кандидат биологических наук

Лапотышкина Л. И.

Агафодорова М. Н., кандидат биологических наук

Косолапов В. М., академик РАН, доктор сельскохозяйственных наук

ФНЦ «ВИК им. В. Р. Вильямса», лаборатория сельскохозяйственной биотехнологии

141055, Россия, Московская обл., г. Лобня, Научный городок, корп. 1

E-mail: fncvikbio@yandex.ru

Изложены результаты изучения семенной продуктивности кислотоустойчивых образцов клевера лугового F₃211 и F₃236 с использованием методов биотехнологии. Исследования проводили в условиях селекционно-тепличного комплекса, в камерах искусственного климата. Цель исследований — оценить лабораторными и вегетационными методами показатели семенной продуктивности кислотоустойчивых форм клевера лугового. При оценке in vitro в селективных условиях с различными концентрациями ионов алюминия наибольшую устойчивость показали проростки F₃211, у которых в варианте с 50 мг/л Al³⁺ образовались корни длиннее на 45,2%, чем у проростков F₃30 (ВИК). Лучшие растения клевера лугового, полученные из устойчивых к ионам алюминия проростков, превышали контрольные растения по числу побегов на 53,6% и соцветий — на 186,3%. При этом токсическое последействие ионов алюминия в большей степени повлияло на образование цветков и семян в соцветиях клевера лугового. Так, у F₃211 растений, полученных из проростков в вариантах с 50 и 100 мг/л Al³⁺, процент цветков и семян в одном соцветии был на 5,4 и 13,6%; 6,7 и 9,3% соответственно ниже по отношению к соответствующему контролю (вода). Отбор in vitro на уровне проростков F₃211 и F₃236 в селективных условиях повысил показатели семенной продуктивности по сравнению с исходными образцами F₂211 и F₂236: у F₃211 по числу побегов — на 213,3%, числу соцветий — на 131,2%, у F₃236 — на 47,4% и 48,5% соответственно. При этом лучшие растения по продуктивности семян с одного растения превышали таковую у F₃211 на 115,7%, у F₃236 — на 45,3%.

Ключевые слова: клевер луговой, кислотоустойчивость, кислотовыносливость, способ отбора in vitro, ионы алюминия, проростки, семенная продуктивность.

Многолетние травы (в том числе клевер луговой и люцерна) играют большую роль в обеспечении кормами животноводства и повышении его продуктивности. Получение высоких урожаев трав в районах Нечернозёмной зоны не только обеспечит скот грубыми кормами и улучшит плодородие дерново-подзолистых почв, но и создаст условия для высокой продуктивности всех сельскохозяйственных культур. Важнейшая роль в реализации потенциальных возможностей этих многолетних бобовых кормовых культур принадлежит сорту. Селекция этих культур (в том числе и создание перспективного исходного материала) ведётся в направлении повышения устойчивости к неблагоприятным почвенно-климатическим условиям среды и увеличения урожайности кормовой массы и семян (Косолапов, Костенко, Пилипко, 2018; Новосëлов и др., 2019; Косолапов, Чернявских, Костенко, 2021).

Культурные растения, особенно их высокопродуктивные сорта, очень требовательны к почвенным условиям. Растения семейства бобовых имеют резко отрицательную реакцию на повышенную кислотность почвы. Большая часть кислых почв дерново-подзолистая, они бедны органическим веществом и элементами питания. В России площадь почв с избыточной кислотностью достигает более 60 млн га и значительная часть из них — пахотные земли (Кедрова и др., 2019).

В отделе биотехнологии ВНИИ кормов им. В. Р. Вильямса разработана селективная система отбора in vitro, адекватно отражающая токсические факторы почвенной кислотности, способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового (Солодкая, Агафодорова, Лапотышкина, 2016), а также способ отбора кислотовыносливых форм в различных неустойчивых к ионам алюминия образцах клевера лугового, позволяющие значительно увеличить число растений, способных преодолевать токсическое влияние А1³⁺ и повышенной кислотности среды (Солодкая, Лапотышкина, Агафодорова, 2021). С использованием разработанных способов созданы кислотоустойчивые образцы клевера лугового.

Известно, что кислые почвы наряду с ионами водорода содержат значительное количество ионов алюминия. Отрицательное влияние кислотности очень многосторонне. Токсическое действие ионов Al³⁺ на растения проявляется с момента прорастания семян (Тиунов, 1967) и отражается, прежде всего, на корневой системе (Климашевский, Малышева, 1977, Новосëлов и др., 2015). В процессе роста и развития растений избыток алюминия препятствует поглощению, транспорту и использованию важнейших элементов питания (Ca, Mg, P, K, Fe) (Foy, 1984). Известно также, что подвижные формы алюминия оказывают отрицательное воздействие и на отрастание растений после скашивания, нарушают процессы закладывания репродуктивных органов, что в последующем отражается на процессе оплодотворения и урожае семян (Авдонин, 1971).

Цель исследований — оценить лабораторными и вегетационными методами показатели семенной продуктивности кислотоустойчивых форм клевера лугового.

Методика исследований. Исследования проводили на базе лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии, а также селекционно-тепличного комплекса Всероссийского научно-исследовательского института кормов им. В. Р. Вильямса. Объекты исследований — семенное поколение F₃ кислотовыносливых генотипов клевера лугового (Trifolium pratense L.) 211 и 236, прошедших оценку в грунтовой теплице и характеризующихся повышенной устойчивостью к мучнистой росе (балл поражения 0 и 1).

Для оценки кислотоустойчивости проростков проращивание семян проводили в условиях ламинар-бокса и камеры искусственного климата, в стерильных чашках Петри с фильтровальной бумагой, в трёхкратной повторности. В качестве селективного фактора использовали стерильный раствор хлорида алюминия необходимой для вариантов опыта концентрации ионов алюминия, приготовленный из отдельно проавтоклавированных дистиллированной воды и соли. В каждую чашку Петри добавляли по 20 мл раствора, соответствующего варианту опыта. В качестве контрольного варианта использовали дистиллированную воду. Семена скарифицировали механическим путём, стерилизовали в растворе диоцида в течение 5 минут, затем отмывали трёхкратно стерильной дистиллированной водой и помещали в чашки Петри. Культивирование семян проводили в камере искусственного климата: сначала 3 суток — в темноте, а затем 3 недели — при освещении 4 тыс. лк и температуре 21℃. Учитывали длину образовавшихся корней и проростков и число погибших проростков. Все выжившие проростки помещали в кассеты для выращивания растений с почвой (pH — 4,1). Образовавшиеся растения в фазе трёх-пяти настоящих листьев пересаживали в вегетационные сосуды с почвой нормальной кислотности. Учёт высоты растений и числа побегов проводили в фазу полного цветения растений, а учёт числа соцветий и их обсеменённость — в фазу полного созревания головок. Соцветия собирали по мере их созревания дважды за лето.

Результаты исследований. Для характеристики морфо-биологических признаков клевера лугового (Trifolium pratense L.) были отобраны растения F₂211 и F₂236, показавшие лучшие результаты при оценке в условиях грунтовой теплицы и с повышенной устойчивостью к мучнистой росе (Agafodorova et al., 2021).

Семена растений клевера лугового F₃211 и F₃236, полученные на изолированных площадках в условиях открытого грунта, помещали, предварительно поверхностно простерилизовав, в стерильные чашки Петри в соответствии с вариантами опыта (50 и 100 мг/л Al³⁺) для изучения кислотоустойчивости in vitro. В качестве контрольного варианта использовали дистиллированную воду. После 3 недель культивирования проростки формировали побеги, длина которых варьировалась в среднем в зависимости от образца и варианта опыта от 5,1 до 19,1 мм, что составляло по отношению к контролю (Н₂О) 38,3–121,7%. Наибольшую устойчивость в варианте с 50 мг/л Al³⁺ показал образец F₃211 (121,7%) (табл. 1).

1. Кислотоустойчивость F₃-проростков различных образцов клевера лугового

При этом размер проростков у этого образца был в среднем 11,1 мм, что составляет 102,8% к контролю. Проростки образца 30 (ВИК 7), показавшие наименьшую устойчивость к почвенной кислотности в варианте с 50 мг/л Al³⁺, образовали в среднем побеги длиной 16,1 мм и корни — 11,8 мм, что составило 89,9 и 57,6% к контролю соответственно. В варианте со 100 мг/л Al³⁺ все проростки образца F₃30 погибли, что говорит о низкой кислотоустойчивости данного образца. Необходимо отметить, что исходный F₁30-образец при оценке в полевых условиях на почвах с 10–15 мг обменного алюминия на 100 г почвы и рН — 3,8–4,5 также показал самую низкую из всех оценённых образцов кислотоустойчивость.

У образца F₃236 проростки в варианте с 50 мг/л Al³⁺ имели по отношению к контролю побеги длиной 77,3% и корни — 79,3%. В варианте с 100 мг/л Al³⁺ выжили всего пять проростков образца F₃236, длина побегов которых составляла 5,1 мм и корней — 2,6 мм. Выжившие проростки (один проросток — один генотип) всех образцов были высажены в кассеты с кислой почвой (рН — 4,1), через 3 недели они сформировали растения с тремя-пятью настоящими тройчатыми листьями. При этом процент выживших по отношению к контролю растений во всех вариантах опыта был различным: у F₃211 в варианте с 50 мг/л Al³⁺ — 131,3, со 100 мг/л Al³⁺ — 37,5; у F₃236 в варианте с 50 мг/л Al³⁺ — 83,3, со 100 мг/л Al³⁺ — 27,8; у F₃30 в варианте с 50 мг/л Al³⁺ — 76,5.

Для дальнейшей оценки выживших во всех вариантах опыта растений клевера лугового они были пересажены из кассет с кислой почвой в вегетационные сосуды с почвой нормальной кислотности. Оценка по показателям кислотовыносливости проведена как в закрытом грунте, так и на изолированных площадках открытого грунта (табл. 2).

Исходные кислотовыносливые растения-регенеранты изучаемых образцов были получены способом, основанным на отборе in vitro из морфогенной ткани с высоким индексом роста (ИР) в селективных условиях на питательной агаризованной среде со 100 мг/л Al³⁺. Получаемые из морфогенной ткани с ИР больше 5 характеризовались в 4–6 раз большей выживаемостью, после трёх скашиваний в течение 3 лет выращивания в вегетационном опыте имели в 2–4 раза большую высоту и образовывали в 3,0–3,5 раза больше соцветий, чем растения-регенеранты, полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0 (Солодкая, Лапотышкина, Агафодорова, 2021). F₃-растения клевера лугового образца 211 как в варианте с 50 мг/л Al³⁺, так и в варианте со 100 мг/л Al³⁺ уступали по высоте контрольным растениям на 12,9 и 17,6% соответственно. Тогда как F₃-растения клевера

2. Сравнительное изучение кислотовыносливости различных образцов клевера лугового

лугового образца 236 в обоих вариантах опыта практически не уступали по данному показателю контрольным растениям. Лучшие растения F₃211 (вариант со 100 мг/л Al³⁺) в условиях теплицы превышали контрольные растения по числу побегов на 53,6% и соцветий — на 186,3% (табл. 2).

Известно, что кислая реакция среды и подвижные формы алюминия нарушают процессы закладывания репродуктивных органов, что в последующем отражается на процессе оплодотворения и урожае семян (Авдонин, 1971).

У растений F₃-образцов клевера лугового с различной устойчивостью к ионам алюминия на уровне проростков образовалось в среднем по отношению к соответствующему контролю меньшее число цветков в соцветии. Лучшие результаты были у образца F₃211 (цветков — 94,6 и 86,4%; семян — 93,3 и 80,7% в зависимости от варианта опыта) (табл. 3).

3. Показатели семенной продуктивности образцов клевера лугового

Процент образовавшихся семян в цветках одного соцветия у растений клевера лугового (обсеменённость) образца F₃236 незначительно превышал аналогичный показатель образца F₃211 (в среднем на 6,1%) и был несколько выше при осеннем сборе (табл. 3). На обсеменённость в более значительной степени повлияло токсическое последействие ионов алюминия в селективных условиях отбора in vitro на уровне проростков (Солодкая, Лапотышкина, Агафодорова, 2017). У растений из проростков F₃236, отобранных в варианте опыта с 100 мг/л Al³⁺, она была ниже на 15,7–22,8%, а у F₃211 — на 4,4–15,0%, чем в варианте с 50 мг/л Al³⁺.

Избыток алюминия препятствует поглощению, транспорту и использованию важнейших элементов питания (Тиунов, 1967; Климашевский, 1983), под действием Н⁺ и Al³⁺ часто происходят изменения в углеводном и белковом обмене, что выражается в уменьшении содержания углеводов и белков (Авдонин, 1971). Сравнительное изучение результатов химического анализа растений клевера лугового, полученных из проростков во всех вариантах опыта, показало превышение содержания в среднем у растений образцов F₃211 и F₃236 сухого вещества на 2,3–15,2% и сырой клетчатки — на 4,8–23% в зависимости от варианта опыта. Тогда как содержание сырого протеина у всех образцов было на 2,9–8,5%, а фосфора — на 2,3–9,1% ниже, чем в контроле (вода). При этом содержание калия у всех образцов (кроме образца 236) в опытных вариантах превышало контроль на 1,1–10,1%. Наибольшее превышение было у образца 30 (ВИК), показавшего наименьшую кислотоустойчивость при оценке в полевых условиях.

Показатели семенной продуктивности клевера лугового как среди растений F₃211, так и F₃236 значительно варьировались. В табл. 2 и 3 представлены средние данные по числу побегов, соцветий, цветков и семян в одном соцветии. Для клонирования методом культуры почек in vitro были отобраны шесть генотипов F₃211 и пять генотипов F₃236 с высокими показателями продуктивности. Высота отобранных растений была 185–219 см, число побегов — 21–26, соцветий — 436–541. При этом растения F₃211 существенно превышали F₂211 по числу побегов (на 213,3%), соцветий — на 131,2%; растения F₃236 — на 47,4 и 48,5% соответственно (табл. 4). Продуктивность семян с одного растения в изолированных условиях составляла у F₃211 в среднем 39,5 г/растение, у F₃236 — 21,5 г/растение.

4. Показатели семенной продуктивности образцов клевера лугового с повышенной устойчивостью к ионам алюминия

Заключение. Таким образом, проведённые исследования с использованием методов биотехнологии позволили получить кислотоустойчивые образцы клевера лугового с повышенной семенной продуктивностью, превышающей аналогичный показатель исходных образцов на 45,3–115,7%. По итогам исследований в условиях грунтовой теплицы и на изолированных площадках можно рекомендовать полученные образцы F₃211 и F₃236 для дальнейшей селекционной работы на почвах с повышенной кислотностью, а также рекомендовать отобранные генотипы клевера лугового для молекулярно-генетического анализа признака «кислотоустойчивость» с использованием SRAP-праймеров и других технологий.

Литература

1. Авдонин Н. С. Al в дерново-подзолистых почвах / Н. С. Авдонин // Агрохимия. — 1971. — № 7. — С. 94–103.
2. Влияние алюмокислого стресса на морфо-биологические показатели генотипов озимой ржи / Л. И. Кедрова, Е. И. Уткина. Е. А. Шляхтина, Е. С. Парфёнова, М. Г. Шамова // Успехи современного естествознания. — 2019. — № 12–2. — С.218–223.
3. Климашевский Э. Л. Действие Al³⁺ на деление и растяжение клеток корней гороха / Э. Л. Климашевский, А. С. Малышева // Доклады ВАСХНИЛ. — 1977. — № 10. — С.10–13.
4. Климашевский Э. Л. Почвенная кислотность – генотип – задачи селекции / Э. Л. Климашевский // Вестник сельскохозяйственной науки. — 1983. — № 9. — С.16–25.
5. Косолапов В. М. Направления и задачи селекции кормовых трав в России / В. М. Косолапов, С. И. Костенко, С. В. Пилипко // Достижения науки и техники АПК. — 2018. — № 2. — С.21–24.
6. Косолапов В. М. Новые сорта кормовых культур и технологии для сельского хозяйства России / В. М. Косолапов, В. И. Чернявских, С. И. Костенко // Кормопроизводство. — 2021. — № 6. — С.22–26.
7. Новосёлов М. Ю. Диагностика и отбор устойчивых генотипов клевера к воздействию ионов алюминия и водорода в почве // Основные виды и сорта кормовых культур. — Москва: Наука, 2015. — С.56–60.
8. Изучение различных агроприёмов для повышения семенной продуктивности тетраплоидного клевера лугового / М. Ю. Новосëлов, Л. В. Дробышева, О. А. Старшинова и др. // Кормопроизводство. — 2019. — № 11. — С.32–36.
9. Солодкая Л. А. Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового / Л. А. Солодкая, М. Н. Агафодорова, Л. И. Лапотышкина // Патент РФ № 25883304; БИ. № 13, 2016.
10. Солодкая Л. А. Токсическое последействие ионов алюминия на морфогенные культуры генотипов F₃ кислоточувствительной популяции клевера лугового / Л. А. Солодкая, Л. И. Лапотышкина, М. Н. Агафодорова // Многофункциональное адаптивное кормопроизводство. — Москва, 2017. — Вып. № 13 (61). — С.81–84.
11. Солодкая Л. А. Особенности кислотовыносливости различных неустойчивых к ионам алюминия образцов клевера лугового в культуре in vitro / Л. А. Солодкая, Л. И. Лапотышкина, М. Н. Агафодорова // Кормопроизводство. — 2021. — № 1. — С.26–29.
12. Тиунов А. Н. Физиологическая роль кислотности почвы и ионов Al в жизни растений / А. Н. Тиунов // Вестник сельскохозяйственной науки. — 1967. — № 12. — С.11–16.
13. Some results of the study of Alfalfa and Meadow clover samples created by biotechnology methods / M. N. Agafodorova, P. D. Solozhentsev, L. A. Solodkaya, L. I. Lapotyshkina, I. A. Klimenko, V. A. Dushkin // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. — 2021. — Vol. 901. — P.012027.
14. Foy C. D. Physiological effects of hydrogen, aluminium and manganese toxicities in acid soil / C. D. Foy; ed. F. Adams // Soil acidity and liming. — 1984. — P.57–97.

Biotechnology in the breeding of acid-resistant red clover with high seed productivity

Solodkaya L. A., PhD Biol. Sc.

Lapotyshkina L. I.

Agafodorova M. N., PhD Biol. Sc.

Kosolapov V. M., academician of the Russian Academy of Sciences, Dr. Agr. Sc.

Federal Williams Research Center of Fodder Production and Agroecology, Laboratory of Agricultural Biotechnology

141055, Russia, the Moscow region, Lobnya, Science Town, 1

E-mail: fncvikbio@yandex.ru

This article reports on seed productivity of acid-resistant genotypes of red clover F₃211 and F₃236 using biotechnology methods. The investigation took place in climate chambers of a greenhouse complex. The aim was to test seed productivity of acid-resistant red clover under the lab and greenhouse conditions. Experiments in vitro with various concentrations of aluminum ions showed that F₃211 germs were the most tolerant. When using 50 mg/l Al³⁺ they formed 45.2% longer roots than F₃30 (VIK). The best plants grown from aluminum-resistant germs exceeded the control in shoot number by 53.6%, inflorescence number — by 186.3%. Toxicity of aluminum ions mostly affected flower and seed formation. F₃211 plants, treated previously with 50 and 100 mg/l Al³⁺, produced less flowers and seeds in one inflorescence by 5.4 and 13.6% as well as 6.7 and 9.3%, respectively. In vitro selection of F₃211 and F₃236 germs resulted in better plant productivity: F₃211 exceeded F₂211 in shoot number by 213.3%, inflorescence number — by 131.2% while F₃236 exceeded F₂236 in the same parameters by 47.4% and 48.5%, respectively. The best plants exceeded the productivity per one F₃211 plant by 115.7%, F₃236 — by 45.3%.

Keywords: red clover, acid resistance, acid tolerance, in vitro selection, aluminum ion, germs, seed productivity.

References

1. Avdonin N. S. Al v dernovo-podzolistykh pochvakh / N. S. Avdonin // Agrokhimiya. — 1971. — No. 7. — P.94–103.

2. Vliyanie alyumokislogo stressa na morfo-biologicheskie pokazateli genotipov ozimoy rzhi / L. I. Kedrova, E. I. Utkina. E. A. Shlyakhtina, E. S. Parfenova, M. G. Shamova // Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. — 2019. — No. 12–2. — P.218–223.

3. Klimashevskiy E. L. Deystvie Al³⁺ na delenie i rastyazhenie kletok korney gorokha / E. L. Klimashevskiy, A. S. Malysheva // Doklady VASKhNIL. — 1977. — No. 10. — P.10–13.

4. Klimashevskiy E. L. Pochvennaya kislotnost – genotip – zadachi selektsii / E. L. Klimashevskiy // Vestnik selskokhozyaystvennoy nauki. — 1983. — No. 9. — P.16–25.

5. Kosolapov V. M. Napravleniya i zadachi selektsii kormovykh trav v Rossii / V. M. Kosolapov, S. I. Kostenko, S. V. Pilipko // Dostizheniya nauki i tekhniki APK. — 2018. — No. 2. — P.21–24.

6. Kosolapov V. M. Novye sorta kormovykh kultur i tekhnologii dlya selskogo khozyaystva Rossii / V. M. Kosolapov, V. I. Chernyavskikh, S. I. Kostenko // Kormoproizvodstvo. — 2021. — No. 6. — P.22–26.

7. Novoselov M. Yu. Diagnostika i otbor ustoychivykh genotipov klevera k vozdeystviyu ionov alyuminiya i vodoroda v pochve // Osnovnye vidy i sorta kormovykh kultur. — Moscow: Nauka, 2015. — P.56–60.

8. Izuchenie razlichnykh agropriemov dlya povysheniya semennoy produktivnosti tetraploidnogo klevera lugovogo / M. Yu. Novoselov, L. V. Drobysheva, O. A. Starshinova et al. // Kormoproizvodstvo. — 2019. — No. 11. — P.32–36.

9. Solodkaya L. A. Sposob otbora in vitro kislotoustoychivykh form klevera lugovogo / L. A. Solodkaya, M. N. Agafodorova, L. I. Lapotyshkina // Patent RF No. 25883304; BI. No. 13, 2016.

10. Solodkaya L. A. Toksicheskoe posledeystvie ionov alyuminiya na morfogennye kultury genotipov F3 kislotochuvstvitelnoy populyatsii klevera lugovogo / L. A. Solodkaya, L. I. Lapotyshkina, M. N. Agafodorova // Mnogofunktsionalnoe adaptivnoe kormoproizvodstvo. — Moscow, 2017. — Is. No. 13 (61). — P.81–84.

11. Solodkaya L. A. Osobennosti kislotovynoslivosti razlichnykh neustoychivykh k ionam alyuminiya obraztsov klevera lugovogo v kulture in vitro / L. A. Solodkaya, L. I. Lapotyshkina, M. N. Agafodorova // Kormoproizvodstvo. — 2021. — No. 1. — P.26–29.

12. Tiunov A. N. Fiziologicheskaya rol kislotnosti pochvy i ionov Al v zhizni rasteniy / A. N. Tiunov // Vestnik selskokhozyaystvennoy nauki. — 1967. — No. 12. — P.11–16.

13. Some results of the study of Alfalfa and Meadow clover samples created by biotechnology methods / M. N. Agafodorova, P. D. Solozhentsev, L. A. Solodkaya, L. I. Lapotyshkina, I. A. Klimenko, V. A. Dushkin // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. — 2021. — Vol. 901. — P.012027.

14. Foy C. D. Physiological effects of hydrogen, aluminum and manganese toxicities in acid soil / C. D. Foy; ed. F. Adams // Soil acidity and liming. — 1984. — P.57–97.