Сравнительная оценка сортообразцов клевера лугового с оригиналом сорта Псковский местный двуукосный

УДК 631.524.4

Сравнительная оценка сортообразцов клевера лугового с оригиналом сорта Псковский местный двуукосный

Мазин А. М., кандидат сельскохозяйственных наук

ФГБНУ «Федеральный научный центр лубяных культур»

180559, Россия, Псковская обл., Псковский р-н, д. Родина, ул. Мира, д. 1

E-mail: a.mazin.psk@fnclk.ru

Егги Э. Э., кандидат биологических наук

ФГБНУ ФИЦ «Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова»

190000, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 44

E-mail: zininaanna@yandex.ru

В статье рассмотрены приёмы восстановления высокоурожайного сорта клевера лугового Псковский местный двуукосный селекции Псковского НИИСХ с целью возвращения его в сельскохозяйственное производство Северо-Западного региона РФ. Сорт Псковский местный двуукосный отличается высокой урожайностью, продуктивным долголетием и устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. Имеет повышенный спрос у производственников Псковской области. Однако отсутствие семеноводства, проблемы с выдачей сортовых и посевных документов сдерживают его распространение. Большой интерес представляет использование данного сорта в селекционной работе. В 2018–2020 годах в питомнике ОП Псковского НИИСХ были изучены семь образцов этой культуры (П-101–П-107), полученных из хозяйств области. Посеянные семена собраны с неапробированных посевов предположительно сорта Псковский местный двуукосный, который возделывался в хозяйствах многие годы. Для сравнительного анализа оригинал сорта получили из коллекции ВИР (К-31744). В результате определения типа созревания образцов по количеству междоузлий на стебле и построения вариационных кривых образцы П-103, П-106, П-107 отнесли к позднеспелому типу клевера лугового, что указало на их несоответствие оригиналу. Наиболее близкими по этому показателю к оригиналу оказались образцы П-101, П-102, П-104, П-105. По морфологическим признакам наибольшее сходство с оригиналом имели образцы П-101, П-102, П-103. Методом SDS-электрофореза белковых спектров выявили три позиции, по которым исследованные образцы неапробированных посевов (П-101, П-102, П-103) отличались от К-31744. Для восстановления сорта Псковский местный двуукосный в качестве исходного материала перспективно использование образцов П-101 и П-102 как наиболее схожих с оригиналом по срокам созревания и морфологии. Метод SDS-электрофореза позволяет контролировать селекционные образцы на идентичность сортам клевера лугового.

Ключевые слова: клевер, сортообразец, оригинал, идентичность, вариационные ряды, электрофорез белков.

Значительная роль в производстве качественных кормов принадлежит многолетним бобовым травам и их травосмесям со злаками. Российские учёные предлагают насыщать кормовую площадь бобово-злаковыми травосмесями до 60% (Кутузова, Шпаков, Косолапов и др., 2021). При этом большое внимание уделяется созданию новых сортов, которые должны быть устойчивыми к лимитирующим факторам внешней среды (Косолапов, Пилипко, 2018), иметь повышенное содержание протеина и растворимых углеводов при отсутствии антипитательных веществ (Новосёлов и др., 2013). Особое внимание уделяется освоению в производстве раннеспелых сортов клевера, что позволит полнее использовать агроклиматические ресурсы среды и расширить зону его возделывания (Переправо, Золотарев, Георгиади, 2015). Многими этими качествами при возделывании в условиях Псковской области обладал раннеспелый сорт клевера лугового Псковский местный двуукосный, созданный на основе местных кряжей.

Селекционная работа с Trifolium pratense (L.) в Псковском НИИСХ началась после посещения Псковской областной зональной станции в 1935 году вице-президентом ВАСХНИЛ Н. И. Вавиловым (Филимонов, 2011). Выполняя рекомендации академика, летом 1936 года научные сотрудники станции объехали многие районы области в поисках лучшего исходного семенного материала местных сортов клевера лугового, и в этом же году были заложены основные питомники. Во время Великой отечественной войны опытная база станции была полностью уничтожена, весь селекционный материал был утерян. Селекционную работу по клеверу луговому возобновили в 1946 году. По итогам работы наилучшие местные популяции были оформлены сортами и переданы в государственное сортоиспытание, после которого в 1954 году в Государственном реестре по Северо-Западному региону был зарегистрирован сорт клевера лугового Гдовский местный, а в 1956 году — Псковский местный двуукосный. Сорт Псковский местный двуукосный отличается высокой урожайностью, продуктивным долголетием и устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. В 1960 году селекционная работа с клевером луговым на опытной станции была остановлена. К началу 2010 года промышленное семеноводство клевера лугового прекратилось, селекционные сорта утеряны. В настоящее время в ряде хозяйств области имеются неапробированные посевы клевера лугового предположительно сорта Псковский местный двуукосный, что дало возможность собрать семена с этих полей и провести исследования на идентичность данному сорту.

Сохранение стародавних местных сортов способствует поддержанию сортового разнообразия клевера лугового, пополнению генетической коллекции и использованию их в селекционной работе.

Цель работы — для выявления образцов клевера лугового, наиболее схожих с сортом Псковский местный двуукосный, провести их сравнительный анализ по морфологии, белковому составу семян с оригиналом сорта, а также определить возможность применения метода SDS-электрофореза по Laemli для идентификации образцов вида Trifolium pratense (L.).

Методика исследований. Исследования проводились на опытном поле Псковского НИИСХ в 2018–2020 годах. Почва участка дерново-подзолистая, легкосуглинистая, рН — 6,0, содержание подвижного фосфора — 171 мг/кг почвы, обменного калия — 164 мг/кг почвы, гумуса в пахотном слое — 2,1%.

Питомник исходного материала заложили в третьей декаде мая 2018 года, соблюдая пространственную изоляцию 200 м и более от производственных посевов клевера. Питомник был заложен беспокровно, широкорядным способом, с междурядьями 60 см. Площадь делянки — 6 м², повторность шестикратная.

В питомнике были посеяны образцы клевера лугового (П-101–П-107) предположительно сорта Псковский местный двуукосный, полученные из хозяйств области. Посеянные семена собраны с неапробированных посевов клевера лугового, который возделывается в хозяйствах многие годы. Оригинал сорта получен из коллекции ВИР (К-31744).

При сравнении сортообразцов с оригиналом применили несколько методик или способов. Первоначально необходимо было определить тип клевера лугового по срокам созревания. Для этого использовали «Инструкцию по апробации сортовых посевов» (1995). Морфологические признаки описали по «Методике проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность» (1995). Для проведения SDS-электрофореза белки экстрагировали настаиванием 5 мг муки отдельных семян в 140 мкл 1М мочевины в течение 40 мин. При анализе суммарных белковых экстрактов 50 семян размалывали в муку, тщательно перемешивали и проводили дальнейшие процедуры как для отдельных семян. Электрофорез проводили в 12,5% ПААГ в диссоциирующей системе с меркаптоэтанолом (Laemli, 1970). Процедура электрофореза и обработки гелевых пластин подробно описана для белков семян гороха (Конарев, 2000).

Результаты исследования. Наиболее важный показатель определяющий тип клевера — число междоузлий на стебле растения (Лисицин, 1947). По количеству междоузлий клевер относят к следующим типам: позднеспелый, раннеспелый и промежуточный. Позднеспелый тип характеризуется средним числом междоузлий не менее восьми, одновершинной вариационной кривой с преобладанием (модусом) восьми и девяти междоузлий. Раннеспелый клевер характеризуется средним числом междоузлий пять-семь с одновершинной кривой с модусом пяти-семи междоузлий или односторонней кривой, представленной левой половиной вариационной кривой с модусом не более семи междоузлий включительно. Апробируемые образцы клевера, которые не подходят по числу междоузлий к одному из крайних типов, но в то же время выравнены по морфологическим признакам и времени цветения, относятся к промежуточным типам, и только явно пёстрые по составу популяции относят к смеси разных типов. Согласно карточке регистрации сорта (1956) сорт Псковский местный двуукосный относится к раннеспелому типу и характеризуется средним числом междоузлий шесть с амплитудой колебаний четыре-девять.

Отбор снопов и морфологический анализ изучаемых образцов согласно «Инструкции по апробации сортовых посевов» провели в фазе начала цветения клевера лугового. В процессе изучения все полученные данные по каждому стеблю внесли в таблицу «Вариационный ряд числа междоузлий», на основании которой построили графики вариационных кривых (рис. 1).

Рис. 1. Вариационные кривые числа междоузлий образцов клевера лугового (2018–2020 гг.):

а — оригинала (К-31744); б — образца П-101; в — образца П-103

Анализ вариационных рядов числа междоузлий оригинала (К-31744) из коллекции ВИР показал, что наибольшее число приходится на растения с шестью междоузлиями, при этом график вариационной кривой является одновершинным с модусом 6 (рис. 1а). В образец К-31744 входят в незначительном количестве растения с числом междоузлий семь, восемь и девять. Полученные данные подтверждают, что оригинал представлен в основном раннеспелой популяцией клевера.

Анализ вариационных рядов числа междоузлий образцов П-101, П-102, П-104 и П-105 показал, что в этих образцах наибольшее количество приходится на растения с шестью-семью междоузлиями. Подобный график вариационной кривой с модусом 7 (для образца П-101) показан на рис. 1б. В перечисленных образцах в незначительном количестве встречаются растения с другим количеством междоузлий: 5, 9, 10 и 11. Следовательно, данные образцы представлены в основном раннеспелой и среднеспелой популяциями клевера и по этому показателю более других близки к оригиналу.

Анализ вариационных рядов числа междоузлий образцов П-103 (рис. 1в), П-106 и П-107 показал, что в них наибольшее число приходится на растения с восемью междоузлиями. График вариационной кривой для образца П-103 является одновершинным с модусом 7–9. В перечисленные выше образцы входят в незначительном количестве растения с числом междоузлий 5, 6, 10 и 11. То есть образцы П-103, П-106 и П-107 представлены в основном позднеспелой и среднеспелой популяциями клевера лугового и не могут быть идентифицированы как сорт Псковский местный двуукосный.

Для сравнения образцов по морфологическим признакам рассматривались: форма куста, высота, частота белых меток на листьях, толщина и опушение стебля, окраска соцветия, форма семян, поверхность и окраска, масса 1000 семян (табл.).

По нашим наблюдениям, оригинал (К-31744) имеет полуразвалистую форму куста, среднюю высоту 64 см, стебли средней толщины, у которых отсутствует опушённость. Все сортообразцы клевера лугового были выше оригинала на 6–12 см. Толщина стеблей в фазу цветения клевера у сортообразцов была от средней до толстой (у оригинала — средняя). Опушение стеблей отсутствовало у всех образцов. Все изученные образцы, как и оригинал, имели зелёную и тёмно-зелёную окраску листьев. Сортообразцы П-101 и П-105 содержали незначительное количество стеблей с антоциановой окраской.

На листьях у всех изучаемых образцов клевера ясно выделялись белые метки. Их было много у образцов П-103, П-104, П-105, П-106 и очень много — у П-101, П-102 и П-107. Опушение на листьях отсутствовало у всех образцов, как и у оригинала. Окраска соцветий варьировалась от розовой у П-101, П-104, П-105, П-106, П-107 до розовой и красной — у П-102, П-103 и красной и розовой — у оригинала.

Морфологические признаки образцов Trifolium pratense (L.) (2018–2020 гг.)

Изучаемые образцы клевера лугового (табл.) имели семена продолговато-овальной формы, и только в образцах П-102 и П-103 находили семена с округло-треугольной формой. Семена у всех образцов слегка сплюснутые. Окраска основной массы семян жёлтая с примесью жёлто-фиолетовых семян; образец П-103 имел примесь коричневатых семян. Поверхность у всех семян гладкая и блестящая. Наибольшая масса 1000 семян у большинства образцов, включая оригинал, составляла 1,8–1,9 ± 0,20–0,22 г. Образцы П-101 и П-103 имели более высокое значение этого показателя.

Таким образом, по морфологическим признакам наибольшее сходство с оригиналом имели образцы П-101, П-102, П-103.

Для уточнения данных по морфологии был использован электрофорез белков семян. Анализировали образцы П-101, П-102, П-103 как наиболее сходные с оригиналом по морфологическим признакам. Для определения идентичности образцов оригиналу хорошо зарекомендовали себя белковые электрофоретические спектры. У двудольных растений подобные задачи решаются с помощью SDS-электрофореза белков семян (Конарев, 2000). Такие методические разработки в семействе Fabaceae Lindl. осуществлены в ВИР для идентификации сортов самоопыляемых культур: гороха посевного, вики посевной (Егги, Александрова, 2019), люпина узколистного (Егги, 2013) и перекрёстноопыляемого козлятника восточного (Егги, Гаврилюк, 2015). Различия частот встречаемости отдельных полипептидов или их групп оказались математически достоверными показателями для идентификации сортов козлятника восточного.

Род Trifolium L. относится к перекрёстноопыляемым растениям, которым свойственен высокий полиморфизм, в том числе белковый. На рис. 2 представлены полипептидные (белковые) спектры отдельных семян оригинала Псковский местный двуукосный и сортообразцов П-101 и П-103. Очевидно, чтобы анализировать белковые спектры семян клевера лугового, необходимо получить спектры огромного числа семян, и для обработки этой информации потребуется специальная компьютерная программа. Метод SDS-электрофореза позволяет упростить процедуру, анализируя спектры, полученные из муки многих семян. В таких спектрах можно выявить различия образцов семян по белковому составу (наличие или отсутствие компонента спектра) или различия по интенсивности компонента, указывающие на разную частоту встречаемости отдельных компонентов. Подобный подход был использован для идентификации 20 сортов и форм клевера красного при анализе спектров, полученных из муки 200 семян (Gardiner, Forde, 1988).

Рис. 2. Белковые спектры отдельных семян сорта Псковский местный двуукосный (К-31744) и образцов, собранных со стародавних посевов, предположительно того же сорта — П-101 и П-103 (справа — положения полипептидных метчиков молекулярных масс, кДа)

Рис. 3 демонстрирует спектры оригинала и двух образцов стародавних посевов сорта Псковский местный двуукосный. Их анализ показывает, что нет отличий в спектрах двух выборок по 50 семян оригинала (К-31744) из коллекции ВИР. В спектрах двух выборок образцов стародавних посевов по некоторым позициям зоны с молекулярной массой больше 65 кДа визуально выявляются различия, особенно заметные для образца П-101. Однако эти различия не касались состава полипептидов, а только интенсивности отдельных компонентов. Можно заключить, что такой образец более гетерогенен, чем оригинал, и выборка из 50 семян недостаточна, чтобы спектры повторных выборок полностью совпали.

Рис. 3. Полипептидные спектры семян оригинала Псковский местный двуукосный (К-31744) и образцов, собранных со стародавних посевов, предположительно того же сорта — П-101, П-102, П-103 (справа — положения полипептидных метчиков молекулярных масс, кДа); каждый образец представлен белками из муки двух случайных выборок по 50, каждая выборка представлена двумя спектрами (11, 12 и 21, 22); чёрными точками отмечены выявленные в спектрах различия; белые стрелки — позиции, по которым спектры образцов оригинала качественно отличаются от всех образцов стародавних посевов)

При сравнении образцов П-101, П-102, П-103 с образцом К-31744 их спектры совпали по положению и интенсивности подавляющего большинства компонентов (рис. 3). Тем не менее выявлены три позиции, по которым все исследуемые образцы отличны от оригинала (белые стрелки). Выявленные отличия касались качественного состава белкового спектра (наличия-отсутствия компонента). Таким образом, данные электрофоретического анализа подтвердили данные морфологического исследования о том, что ни один из сортообразцов, собранных из стародавних посевов, а именно образцы П-101, П-102 и П-103, не идентичны оригиналу полностью. Поскольку клевер луговой является перекрёстноопыляемым растением, за годы неконтролируемого возделывания сорта Псковский местный двуукосный в местных хозяйствах генетический состав образцов семян, собранных с его неапробированных посевов, естественно изменился как за счёт естественного перекрёстного опыления с дикорастущими представителями этого вида, так и за счёт естественного отбора растений, приспосабливающихся к ежегодно меняющимся погодным условиям. Это и показало наше исследование. Тем не менее нам удалось отобрать из представленных образцов наиболее подходящие образцы для дальнейшего селекционного отбора.

Следует заметить, что характер группирования и распределения белковых компонентов в электрофоретическом SDS-спектре однозначно свидетельствует о принадлежности всех образцов к виду Trifolium pratense (L.).

Заключение. На основании проведённых исследований по определению количества междоузлий у клевера лугового и полученных вариационных кривых образцы П-103, П-106, П-107 относятся к позднеспелому типу и не соответствуют оригиналу. Наиболее близкими по этому показателю к оригиналу являлись образцы П-101, П-102, П-104, П-105.

По данным морфологических исследований наибольшее сходство с оригиналом имели образцы П-101, П-102, П-103.Для восстановления сорта Псковский местный двуукосный в качестве исходного материала перспективно использование образцов П-101 и П-102 как наиболее близких оригиналу и по морфологии, и по срокам созревания.

При анализе белковых SDS-электрофоретических спектров образцов П-101, П-102, П-103 выявлено их неполное совпадение со спектрами оригинала. Для контроля за дальнейшим процессом селекции отобранных для восстановления сорта образцов следует применять SDS-электрофорез белков семян, используя в качестве контроля оригинальный образец из коллекции ВИР (К-31744).

Использования метода SDS-электрофореза, применимо для сравнительного анализа сортов и образцов Trifolium pratense (L.).

Литература

1. Егги Э. Э. Определение соответствия неизвестного образца вики посевной сорту Юбилейная 110 по данным морфологии и электрофореза белков семян / Э. Э. Егги, Т. Г. Александрова // Зернобобовые и крупяные культуры. — 2019. — № 4 (32). — С.71–80.

2. Егги Э. Э. Идентификация сортов люпина узколистного (Lupinu sangustifolius L.) с использованием электрофоретического спектра полипептидов белков семян / Э. Э. Егги // Методические указания ГНУ ВИР Россельхозакадемии. — 2013. — 27 с.

3. Егги Э. Э. Электрофорез белков семян для сортовой идентификации высокополиморфных культур на примере козлятника восточного (Galega orientalis L.) / Э. Э. Егги, И. П. Гаврилюк // Аграрная Россия. — 2015. — № 11. — С.14–20.

4. Инструкция по апробации сортовых посевов. — Москва, 1995.

5. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / Под ред. В. Г. Конарева. — СПб, 2000. — 186 с.

6. Карточка регистрации сорта для включения в государственное сортоиспытание. — Москва, 1956. — 8 с.

7. Косолапов В. М. Основные методы и результаты селекции многолетних трав / В. М. Косолапов, С. В. Пилипко // Кормопроизводство. — 2018. — № 2. — С.23–28.

8. Состояние и перспективы развития кормопроизводства в Нечернозёмной зоне РФ / А. А. Кутузова, А. С. Шпаков, В. М. Косолапов, Д. М. Тебердиев, В. Т. Воловик // Кормопроизводство. — 2021. — № 2. — С.3–8.

9. Лисицин П. И. Вопросы биологии красного клевера / П. И. Лисицин. — Москва: Сельхозгиз, 1947. — 344 с.

10. Методика проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность клевер луговой Trifolium pratense L. — Москва, 1995. — 4 с.

11. Направление и методы селекции клевера лугового (Trifolium pratense L.) на качество корма / М. Ю. Новосёлов, В. М. Косолапов, Н. Н. Козлов, И. А. Клименко // Адаптивное кормопроизводство. — 2013. — № 1. — С.7–13.

12. Переправо Н. И. Состояние и перспективы развития клеверосеяния и семеноводства клевера разных видов в России / Н. И. Переправо, В. Н. Золотарев, Н. И. Георгиади // Адаптивное кормопроизводство. — 2015. — № 1. — С.14–27.

13. Филимонов А. В. Из истории Псковской сельскохозяйственной опытной станции / А. В. Филимонов // Научно-практический историко-краеведческий журнал. — Псков, 2011. — С.199–217.

14. Laemli U. K. Cleavage of structural protein during assembly of the head of bacteriophage / U. K. Laemli // Natura. — 1970. — Vol. 227. — No. 4. — 680 p.

15. Gardiner S. E. / Biochemical identification of varieties / S. E. Gaardiner, M. B. // L.VIR. — 1988. — P.65–73.

Comparative evaluation of red clover genotypes with the “Pskovskiy mestnyy dvuukosnyy” variety

Mazin A. M., PhD Agr. Sc.

Federal Research Center of Fibre Crops

180559, Russia, the Pskov region, Pskovskiy rayon, Rodina village, Mira str., 1

E-mail: a.mazin.psk@fnclk.ru

Eggi E. E., PhD Biol. Sc.

The All-Russian Vavilov Institute of Plant Genetic Resources

190000, Russia, St. Petersburg, Bolshaya Morskaya str., 44

E-mail: zininaanna@yandex.ru

This article reports on the experiment aimed at improving the performance of red clover “Pskovskiy mestnyy dvuukosnyy” to be cultivated in the North-West region of Russia. The variety was bred at the Pskov Agricultural Research Institute and has high productivity, productive longevity and resistance to environmental stresses. This variety is well-known among the farmers in the Pskov region. However poor seed production together with paper issues have negative impact on its wide cultivation. “Pskovskiy mestnyy dvuukosnyy” is a valuable material for plant breeding. In 2018–2020 the Pskov Agricultural Research Institute collected seven red clover specimens (P-101–P-107) from the regional farms. The collected seeds potentially belonged to the “Pskovskiy mestnyy dvuukosnyy” variety. The original variety was obtained from the Federal Research Center N. I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources (VIR) as a control (K-31744). As a result, P-103, P-106, and P-107 were shown to be long-seasoned and therefore differed from the control. P-101, P-102, P-104, and P-105 were more similar to the control in their maturation rate. However, P-101, P-102, P-103 morphologically were closer to the original variety. SDS-PAGE showed that P-101, P-102, and P-103 differed from the control (K-31744). P-101 and P-102 were used as parent material to improve “Pskovskiy mestnyy dvuukosnyy” since they were more similar to the one.

Keywords: clover, specimen, original, matching, variation series, protein electrophoresis.

References

1. Eggi E. E. Opredelenie sootvetstviya neizvestnogo obraztsa viki posevnoy sortu Yubileynaya 110 po dannym morfologii i elektroforeza belkov semyan / E. E. Eggi, T. G. Aleksandrova // Zernobobovye i krupyanye kultury. — 2019. — No. 4 (32). — P.71–80.

2. Eggi E. E. Identifikatsiya sortov lyupina uzkolistnogo (Lupinu sangustifolius L.) s ispolzovaniem elektroforeticheskogo spektra polipeptidov belkov semyan / E. E. Eggi // Metodicheskie ukazaniya GNU VIR Rosselkhozakademii. — 2013. — 27 p.

3. Eggi E. E. Elektroforez belkov semyan dlya sortovoy identifikatsii vysokopolimorfnykh kultur na primere kozlyatnika vostochnogo (Galega orientalis L.) / E. E. Eggi, I. P. Gavrilyuk // Agrarnaya Rossiya. — 2015. — No. 11. — P.14–20.

4. Instruktsiya po aprobatsii sortovykh posevov. — Moscow, 1995.

5. Identifikatsiya sortov i registratsiya genofonda kulturnykh rasteniy po belkam semyan / Pod red. V. G. Konareva. — St. Petersburg, 2000. — 186 p.

6. Kartochka registratsii sorta dlya vklyucheniya v gosudarstvennoe sortoispytanie. — Moscow, 1956. — 8 p.

7. Kosolapov V. M. Osnovnye metody i rezultaty selektsii mnogoletnikh trav / V. M. Kosolapov, S. V. Pilipko // Kormoproizvodstvo. — 2018. — No. 2. — P.23–28.

8. Sostoyanie i perspektivy razvitiya kormoproizvodstva v Nechernozemnoy zone RF / A. A. Kutuzova, A. S. Shpakov, V. M. Kosolapov, D. M. Teberdiev, V. T. Volovik // Kormoproizvodstvo. — 2021. — No. 2. — P.3–8.

9. Lisitsin P. I. Voprosy biologii krasnogo klevera / P. I. Lisitsin. — Moscow: Selkhozgiz, 1947. — 344 p.

10. Metodika provedeniya ispytaniy na otlichimost, odnorodnost i stabilnost klever lugovoy Trifolium pratense L. — Moscow, 1995. — 4 p.

11. Napravlenie i metody selektsii klevera lugovogo (Trifolium pratense L.) na kachestvo korma / M. Yu. Novoselov, V. M. Kosolapov, N. N. Kozlov, I. A. Klimenko // Adaptivnoe kormoproizvodstvo. — 2013. — No. 1. — P.7–13.

12. Perepravo N. I. Sostoyanie i perspektivy razvitiya kleveroseyaniya i semenovodstva klevera raznykh vidov v Rossii / N. I. Perepravo, V. N. Zolotarev, N. I. Georgiadi // Adaptivnoe kormoproizvodstvo. — 2015. — No. 1. — P.14–27.

13. Filimonov A. V. Iz istorii Pskovskoy selskokhozyaystvennoy opytnoy stantsii / A. V. Filimonov // Nauchno-prakticheskiy istoriko-kraevedcheskiy zhurnal. — Pskov, 2011. — P.199–217.

14. Laemli U. K. Cleavage of structural protein during assembly of the head of bacteriophage / U. K. Laemli // Natura. — 1970. — Vol. 227. — No. 4. — 680 p.

15. Gardiner S. E. / Biochemical identification of varieties / S. E. Gaardiner, M. B. // L.VIR. — 1988. — P.65–73.