Особенности кислотовыносливости различных неустойчивых к ионам алюминия образцов клевера лугового в культуре in vitro

УДК 633.32:631.524.85:581.143.6

Особенности кислотовыносливости различных неустойчивых к ионам алюминия образцов клевера лугового в культуре in vitro

Солодкая Л. А., кандидат биологических наук

Лапотышкина Л. И.

Агафодорова М. Н., кандидат биологических наук

ФНЦ «ВИК им. В. Р. Вильямса», лаборатория сельскохозяйственной биотехнологии

141055, Россия, Московская обл., г. Лобня, Научный городок, корп. 1

E-mail: vniikormov@yandex.ru

В статье изложены результаты исследований токсического влияния ионов алюминия (Al³⁺) на корнеобразовательную способность проростков и индекс роста морфогенной ткани трёх популяций F₂-генотипов (F₂I, F₂II, F₂III) клевера лугового в культуре in vitro. Исследования проводили в 2017–2020 годах на базе селекционно-тепличного комплекса ВНИИ кормов им. В. Р. Вильямса. Показано, что наибольшее число проростков в популяциях F₂-потомства при проращивании на среде с 100 мг/л Al³⁺ было кислотонеустойчивым (без корней и с корнями менее 4,0 мм). В связи с низким числом кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, отобранных ранее разработанным способом, возникла необходимость в дальнейших исследованиях, направленных на увеличение числа генотипов клевера лугового для селекции на кислотоустойчивость. Изучен индекс роста (ИР) морфогенной ткани, получаемой на эпикотилях кислотонеустойчивых проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина с 0 (контроль), 50 и 100 мг/л Al³⁺. При этом наибольший индекс роста на селективной среде со 100 мг/л Al³⁺ отмечали у морфогенной ткани F₂I (в среднем 7,3 при 41,0% к контролю (среда без Al³⁺), наименьший — у F₂III (в среднем 2,9 при 37,1% к контролю). Сравнительное изучение морфобиологических показателей в вегетационном опыте F₂-поколения растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺, показало, что растения-регенеранты клевера лугового, полученные из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0, обладают большей кислотовыносливостью, чем полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0. Таким образом, отбор in vitro по индексу роста морфогенной ткани позволяет значительно увеличить число растений клевера лугового, способных преодолевать токсическое влияние А1³⁺ и повышенной кислотности среды.

Ключевые слова: клевер луговой, кислотовыносливость, корнеобразовательная способность, индекс роста морфогенной ткани, культура in vitro.

Клевер луговой (Trifolium pratense L.) играет большую роль в обеспечении животноводства кормами. Селекция кормовых трав ведётся в направлении повышения устойчивости к неблагоприятным почвенно-климатическим условиям среды и увеличения урожайности кормовой массы и семян (Новосёлов, 2015; Косолапов, Костенко, Пилипко, 2018).

Важное направление в селекционной стратегии кормовых растений ориентировано на создание экологически специализированных сортов, устойчивых к экологическим стрессам (кислотности почвы и токсичности алюминия), для продуктивного освоения при одновременной биотической мелиорации экологически дестабилизированных земель (Косолапов и др., 2015). Площадь почв с избыточной кислотностью в России составляет более 60 млн га и значительная часть из них — пахотные земли (Кедрова и др., 2019). Почвы с повышенной кислотностью содержат наряду с ионами водорода значительное количество ионов алюминия, токсичных для ряда растений. Известно, что токсическое действие ионов Al³⁺ на растения проявляется с момента прорастания семян: период прорастания удлиняется, значительная часть семян погибает (Тиунов, 1967). Избыток алюминия отражается прежде всего на корневой системе. При этом ионы алюминия Al³⁺ тормозят образование новых клеток зоны меристемы (Климашевский, Малышева, 1977). Первичные корни прекращают рост в длину и разбухают, кончики их становятся хрупкими и морщинистыми, длина и общая масса корней резко уменьшаются, что приводит к нарушению способности поглощать воду и питательные вещества (Новосёлов, 2015). Содержание подвижного алюминия в почвах варьируется от 9–10 мг/100 г почвы при рН_HCL — 4,0 до 1,0 мг при рН_HCL — 4,1–5,0 (Козловский и др., 1983). Таким образом, Al³⁺ может быть использован при создании селективных систем.

В отделе биотехнологии ВНИИ кормов им. В. Р. Вильямса разработан способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового. Для достижения поставленной цели — получения кислотоустойчивых растений клевера лугового — разработана селективная система отбора in vitro, адекватно отражающая токсические факторы почвенной кислотности.

К особенностям разработанной селективной системы относится поэтапность отбора in vitro. На первом этапе в качестве селективного фактора использовали непосредственно А1³⁺ в концентрации 100 мг/л в питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (Солодкая, Агафодорова, Лапотышкина, 2016). При этом кислотоустойчивыми считали проростки, сформировавшие корешки не менее 4–5 мм после 7–10 дней культивирования на среде с 100 мг/л А1³⁺. На втором этапе для изучения токсического последействия ионов алюминия оценку проводили на агаризованной среде Гамборга В₅ того же состава, но без добавления ионов алюминия. Через 30 дней после субкультивирования отобранных морфогенных структур наблюдали токсическое последействие селективного фактора, которое выражалось в снижении способности культурами in vitro клевера лугового формировать морфогенную ткань и растения-регенеранты с корнями (Солодкая, Лапотышкина, Агафодорова, 2017).

Отобраные in vitro растения-регенеранты были изучены в условиях поля на почвах с повышенной кислотностью (рН — 2,8 и 26 мг Al³⁺ на 100 г почвы) (Онучина, Тумасова, 2007), они показали повышенную устойчивость к условиям выращивания, что свидетельствует об адекватности разработанной селективной системы отбора in vitro условиям почвенной кислотности.

Разработанный способ предполагает создание кислотоустойчивых популяций на основе отобранных in vitro устойчивых к Al³⁺ генотипов. Однако у ряда сортообразцов число устойчивых генотипов варьируется и может не превышать 7,4% (например, 30 ВИК 7). Это значительно обедняет популяцию по другим не менее ценным селекционным признакам (высокой семенной и кормовой продуктивности, раннеспелости, устойчивости к болезням), не коррелирующим с признаком кислотоустойчивости.

В связи с этим целью работы явилось изучение особенностей кислотовыносливости различных неустойчивых к ионам алюминия образцов клевера лугового в культуре in vitro.

Методика исследований. Исследования проводили в 2017–2020 годах в лабораторных и вегетационных опытах на базе селекционно-тепличного комплекса ВНИИ кормов на поколении F₂ растений клевера лугового — образцах F₂I, F₂II, F₂III с низкой устойчивостью к почвенной кислотности. Из данных образцов клевера лугового проводили отбор in vitro генотипов, выдерживающих концентрацию селективного фактора Al³⁺ 100 мг/л в питательной среде Гамборга В₅. Среду и соль алюминия стерилизовали раздельно автоклавированием в течение 30 мин при 1,25 атм, а затем смешивали в стерильных условиях до момента застывания среды. Морфогенную ткань (ткань с очагами морфогенеза) получали путём субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4–5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al³⁺на среду того же состава, но без Al³⁺. Индекс роста определяли через 3–4 недели после повторного культивирования эксплантов (кусочков морфогенной ткани) на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³⁺ путём отношения наросшей в процессе культивирования массы морфогенной ткани к массе начального экспланта. Изучали морфобиологические показатели растений-регенерантов клевера лугового, образовавшихся в морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³⁺ и выживших после трёх-четырёх скашиваний в течение 3 лет вегетации в грунтовой теплице. Учёты и наблюдения проводили по методике ВНИИ кормов (Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера, 2002).

Результаты исследований. В процессе исследований было изучено токсическое влияние Al³⁺ на корнеобразовательную способность проростков клевера лугового в культуре in vitro.

В результате опытов, проведённых на F₂-потомстве растений клевера лугового с низкой кислотоустойчивостью, было показано, что число генотипов с корнями ≥4 мм на селективной агаризованной среде Гамборга В₅ с 100 мг/л Al³⁺ было незначительным и составляло у F₂I 0,9%; у F₂II — 18,3% и у F₂III — 7,4% (табл. 1).

Наибольшее число проростков в популяциях F₂-потомства при проращивании на среде со 100 мг/л Al³⁺ было без корней и с корнями менее 4,0 мм (соответственно 31,1 и 7,1 шт. — у F₂I; 20,7 и 11,0 шт. — у F₂II; 32,0 и 10,6 шт. — у F₂III).

В связи с низким числом кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, отобранных ранее разработанным способом, возникла необходимость в дальнейших исследованиях по увеличению числа генотипов

1. Токсическое влияние Al³⁺ на корнеобразовательную способность проростков клевера лугового в культуре in vitro

клевера лугового для селекции на кислотоустойчивость.

С этой целью для определения кислотовыносливости in vitro трёх популяций F₂-генотипов клевера лугового (F₂I, F₂II, F₂III) использовали эпикотили проростков без корней и с корнями менее 4,0 мм, помещали их на питательную агаризованную среду Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина до образования морфогенной ткани. Кусочки образовавшейся морфогенной ткани (экспланты) клевера лугового после взвешивания культивировали 3–4 недели на агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина с 0 (контроль), 50 и 100 мг/л Al³⁺ до образования морфогенной ткани с побегами.

Определение индекса роста (ИР) показало следующие результаты (табл. 2). Наибольший ИР на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ отмечали у морфогенной ткани F₂I (в среднем 7,3 при 41,0% к контролю (cреда без Al³⁺)), наименьший — у F₂III (в среднем 2,9 при 37,1% к контролю).

2. Оценка кислотовыносливости in vitro F₂ трёх генотипов клевера лугового

Все побеги с корнями, образовавшиеся из морфогенной ткани клевера лугового на среде с 100 мг/л Al³⁺, высаживали из чашек Петри в кассеты для выращивания растений с почвой, имеющей повышенную кислотность (рН — 4,1), а затем в грунтовую теплицу при индивидуальном стоянии с целью сравнительного изучения морфобиологических показателей F₂-поколения растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺.

Число выживших растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с индексом роста не менее 5,0, после трёх скашиваний в течение 3 лет вегетации в вегетационном опыте на почве с нормальной кислотностью составляло: у F₂I — 84,1%, у F₂II — 89,1%, F₂III — 69,3%, что значительно превышало этот показатель у растений-регенерантов, полученных из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0 (у F₂I — в 24,5 раза; у F₂II — в 16,0 раз; у F₂III — в 14,6 раза) (табл. 3). При этом растения, регенерированные из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0, превосходили полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0 по высоте в 2,5–5,9 раза, по числу стеблей — в 2,0–4,3 раза и по числу соцветий — в 2,5–2,6 раза.

3. Сравнительное изучение морфобиологических показателей F₂ растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с различным индексом роста

Всё это свидетельствует о том, что растения-регенеранты клевера лугового, полученные из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0, обладали большей кислотовыносливостью, чем полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0.

Заключение. Таким образом, в результате проведённых исследований было установлено, что большее число проростков в изучаемых популяциях F₂-потомства клевера лугового при проращивании на среде со 100 мг/л Al³⁺ были кислотонеустойчивыми — без корней и с корнями менее 4,0 мм (31,1 и 7,1 шт. — у F₂I; 20,7 и 11,0 шт. — у F₂II; 32,0 и 10,6 шт. — у F₂III). Изучение индекса роста (ИР) морфогенной ткани, изначально образовавшейся на эпикотилях этих неустойчивых проростков, а затем культивируемой на питательной агаризованной среде Гамборга В₅ с 2 мг/л 6-бензиламинопурина с 0 (контроль), 50 и 100 мг/л Al³⁺, показало, что наибольший ИР на селективной среде с 100 мг/л Al³⁺ отмечался у морфогенной ткани F₂I (в среднем 7,3 при 41,0% к контролю (cреда без Al³⁺)), наименьший — у F₂III (в среднем 2,9 при 37,1% к контролю).

При сравнительном изучении морфобиологических показателей в вегетационном опыте растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0, показано, что они обладают большей кислотовыносливостью, чем полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0, и превышают последние по высоте в 2,5–5,9 раза, по числу стеблей — в 2,0–4,3 раза и по числу соцветий — в 2,5–2,6 раза.

Следовательно, отбор in vitro по индексу роста морфогенной ткани в селективных условиях позволяет значительно увеличить число растений клевера лугового, способных преодолевать токсическое влияние А1³⁺ и повышенной кислотности среды.

Литература

1. Климашевский Э. Л. Действие Al³⁺ на деление и растяжение клеток корней гороха / Э. Л. Климашевский, А. С. Малышева // Доклады ВАСХНИЛ. — 1977. — № 10. — С.10–13.

2. Влияние алюмокислого стресса на морфо-биологические показатели генотипов озимой ржи / Л. И. Кедрова, Е. И. Уткина. Е. А. Шляхтина, Е. С. Парфёнова, М. Г. Шамова // Успехи современного естествознания. — 2019. — № 12–2. — С.218–223.

3. Известкование почв / Е. В. Козловский, А. Н. Небольсин, Ю. В. Алексеев, П. А. Чуриков. — Ленинград: Колос, 1983. — С.8–19.

4. Приоритеты экологической безопасности в сельском хозяйстве / В. М. Косолапов, И. А. Трофимов, Л. С. Трофимова, Е. П. Яковлева // Многофункциональное адаптивное кормопроизводство. Вып. 7 (55). — Москва, 2015. — С.5–11.

5. Косолапов В. М. Направления и задачи селекции кормовых трав в России / В. М. Косолапов, С. И. Костенко, С. В. Пилипко // Достижения науки и техники АПК. — 2018. — № 2. — С.21–24.

6. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. — Москва: РАСХН, ВИК, 2002. — 68 с.

7. Новосёлов М. Ю. Селекция клевера лугового на повышение адаптивности к неблагоприятному воздействию биотических и абиотических факторов среды (при создании сортов нового поколения) в Центральном Нечернозёмном регионе Российской Федерации / М. Ю. Новосёлов // Экологическая селекция и семеноводство клевера лугового. — Москва, 2012. — С.22–56.

8. Новосёлов М. Ю. Диагностика и отбор устойчивых генотипов клевера к воздействию ионов алюминия и водорода в почве / М. Ю. Новосёлов // Основные виды и сорта кормовых культур. — Москва: Наука, 2015. — С.56–60.

9. Онучина О. Л. Методы и результаты селекции клевера лугового на повышенную кислотоустойчивость / О. Л. Онучина, М. И. Тумасова // Кормопроизводство. — 2007. — № 4. — С.27–28.

10. Солодкая Л. А. Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового / Л. А. Солодкая, М. Н. Агафодорова, Л. И. Лапотышкина // Патент РФ №25883304. БИ №13, 2016.

11. Солодкая Л. А. Токсическое последействие ионов алюминия на морфогенные культуры генотипов F₃ кислоточувствительной популяции клевера лугового / Л. А. Солодкая, Л. И. Лапотышкина, М. Н. Агафодорова // Многофункциональное адаптивное кормопроизводство. Вып. 13 (61). — Москва, 2017. — С.81–84.

12. Тиунов А. Н. Физиологическая роль кислотности почвы и ионов Al в жизни растений / А. Н. Тиунов // Вестник сельскохозяйственной науки. — 1967. — № 12. — С.11–16.

Acid-resistance of aluminum-sensitive red clover in vitro

Solodkaya L. A., PhD Biol. Sc.

Lapotyshkina L. I.

Agafodorova M. N., PhD Biol. Sc.

Federal Williams Research Center of Fodder Production and Agroecology, laboratory of Agricultural Biotechnology

141055, Russia, the Moscow region, Lobnya, Science Town, 1

E-mail: vniikormov@yandex.ru

This article deals with the toxic effect of aluminum ions (Al³⁺) on root-forming capacity of seedlings and growth index of morphogenic tissue of three populations of red clover (F₂I, F₂II, F₂III) in vitro. The experiments took place in 2017–2020. Most F₂ seedlings were sensitive to high acidity on the medium with 100 mg/l of Al³⁺ (without roots or with roots up to 4.0 mm). The aim was to improve acid-resistance of clover genotypes. Growth index of morphogenic tissue of low-tolerant genotypes was tested on Gamborg В₅ agar with 2 mg/l of 6-benzylaminopurine and 0 (control), 50 or 100 mg/l of Al³⁺. Morphogenic tissue of F₂I had the highest growth index under 100 mg/l of Al³⁺ (7.3) while F₂III — the lowest one (2.9). These populations exceeded the control in this parameter by 41.0 and 37.1%, respectively. F₂ plants regenerated from the morphogenic tissue with growth index of over 5.0 under 100 mg/l of Al³⁺ showed higher tolerance to acidity. Therefore, in vitro selection according to growth index of morphogenic tissue could be used to obtain plants resistant to the toxic effect of А1³⁺ and high acidity.

Keywords: red clover, acid-resistance, root-forming capacity, growth index, morphogenic tissue, in vitro.

References

1. Klimashevskiy E. L. Deystvie Al3+ na delenie i rastyazhenie kletok korney gorokha / E. L. Klimashevskiy, A. S. Malysheva // Doklady VASKhNIL. — 1977. — No. 10. — P.10–13.

2. Vliyanie alyumokislogo stressa na morfo-biologicheskie pokazateli genotipov ozimoy rzhi / L. I. Kedrova, E. I. Utkina. E. A. Shlyakhtina, E. S. Parfenova, M. G. Shamova // Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. — 2019. — No. 12–2. — P.218–223.

3. Izvestkovanie pochv / E. V. Kozlovskiy, A. N. Nebolsin, Yu. V. Alekseev, P. A. Churikov. — Leningrad: Kolos, 1983. — P.8–19.

4. Prioritety ekologicheskoy bezopasnosti v selskom khozyaystve / V. M. Kosolapov, I. A. Trofimov, L. S. Trofimova, E. P. Yakovleva // Mnogofunktsionalnoe adaptivnoe kormoproizvodstvo. Is. 7 (55). — Moscow, 2015. — P.5–11.

5. Kosolapov V. M. Napravleniya i zadachi selektsii kormovykh trav v Rossii / V. M. Kosolapov, S. I. Kostenko, S. V. Pilipko // Dostizheniya nauki i tekhniki APK. — 2018. — No. 2. — P.21–24.

6. Metodicheskie ukazaniya po selektsii i pervichnomu semenovodstvu klevera. — Moscow: RASKhN, VIK, 2002. — 68 p.

7. Novoselov M. Yu. Selektsiya klevera lugovogo na povyshenie adaptivnosti k neblagopriyatnomu vozdeystviyu bioticheskikh i abioticheskikh faktorov sredy (pri sozdanii sortov novogo pokoleniya) v Tsentralnom Nechernozemnom regione Rossiyskoy Federatsii / M. Yu. Novoselov // Ekologicheskaya selektsiya i semenovodstvo klevera lugovogo. — Moscow, 2012. — P.22–56.

8. Novoselov M. Yu. Diagnostika i otbor ustoychivykh genotipov klevera k vozdeystviyu ionov alyuminiya i vodoroda v pochve / M. Yu. Novoselov // Osnovnye vidy i sorta kormovykh kultur. — Moscow: Nauka, 2015. — P.56–60.

9. Onuchina O. L. Metody i rezultaty selektsii klevera lugovogo na povyshennuyu kislotoustoychivost / O. L. Onuchina, M. I. Tumasova // Kormoproizvodstvo. — 2007. — No. 4. — P.27–28.

10. Solodkaya L. A. Sposob otbora in vitro kislotoustoychivykh form klevera lugovogo / L. A. Solodkaya, M. N. Agafodorova, L. I. Lapotyshkina // Patent RF No.25883304. BI No.13, 2016.

11. Solodkaya L. A. Toksicheskoe posledeystvie ionov alyuminiya na morfogennye kultury genotipov F3 kislotochuvstvitelnoy populyatsii klevera lugovogo / L. A. Solodkaya, L. I. Lapotyshkina, M. N. Agafodorova // Mnogofunktsionalnoe adaptivnoe kormoproizvodstvo. Is. 13 (61). — Moscow, 2017. — P.81–84.

12. Tiunov A. N. Fiziologicheskaya rol kislotnosti pochvy i ionov Al v zhizni rasteniy / A. N. Tiunov // Vestnik selskokhozyaystvennoy nauki. — 1967. — No. 12. — P.11–16.